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羅丹明標記鬼筆環肽 免疫類產品

鬼筆環肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結合，通常用來標記組織切片，細胞培養物或無細胞體系中的F-actin，從而對F-actin進行定性和定量分析。另外，鬼筆環肽衍生物也以相近的親和力結合于大小纖維，無論是動植物來源的肌肉細胞或非肌肉細胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環肽分子的計量比結合。且非特異性結合幾乎可忽略，染色區域和非染色區域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進行相關研究。另外鬼筆環肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動蛋白結合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發生反應；鬼筆環肽標記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質；以及甘油抽提的肌纖維標記后仍可收縮等。
鬼筆環肽（Phalloidin）的結合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩定微絲結構，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發生的臨界濃度（CC）降＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。
本品為TRITC（四甲基異(yi)(yi)硫氰酸羅丹明(ming)）標記(ji)的鬼筆環肽，染色(se)反應特(te)(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)強，對(dui)比性(xing)(xing)(xing)高，具有比Actin抗體(ti)更好的染色(se)效果(guo)，適合用作F-actin的定性(xing)(xing)(xing)和(he)定量檢測。另外，經本品結合后(hou)的F-actin仍能維持(chi)actin自身具有的許多(duo)生(sheng)物學(xue)特(te)(te)性(xing)(xing)(xing)。且本品的結合沒有物種差異(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)，適用性(xing)(xing)(xing)廣泛。

1. 工作液準備

本品以溶于甲醇的(de)(de) 20µM 儲存液(ye)(ye)形式提供(gong)，總(zong)量為 300µl。按照(zhao) 100 nM 的(de)(de)工(gong)作(zuo)液(ye)(ye)濃度來換算(suan)，可制備(bei)總(zong)量為 60 ml 的(de)(de)工(gong)作(zuo)液(ye)(ye)。建議收到產品后，根據單次使用量，對母液(ye)(ye)進行(xing)小量分(fen)裝(zhuang)，-20℃避光凍存，一年(nian)穩定。開始實 驗前，使用 1×PBS 緩沖液(ye)(ye)稀釋儲存液(ye)(ye)到需要的(de)(de)工(gong)作(zuo)濃度。推薦工(gong)作(zuo)濃度為：80~200nM。現配現用。

2. 染色步驟

1） 細胞爬片(pian)生長(chang) 24h，使(shi)其(qi)密度達到 50%匯(hui)合度。

2） 吸掉(diao)培養液，37℃預熱的 1×PBS（pH 7.4）清洗細(xi)胞 2 次(ci)。

3） 使用溶(rong)于 PBS 的(de) 4%甲醛溶(rong)液進(jin)行(xing)細胞固定(ding)，室溫固定(ding) 10min。 注意：避(bi)免固定(ding)劑中含(han)有甲醇(chun)成分，因為甲醇(chun)在固定(ding)過(guo)程中可(ke)能破壞肌動蛋白。

4） 室溫條件下，用 PBS 清洗細(xi)胞 2~3 次，每(mei)次 10min。

5） 室溫條件下(xia)，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處(chu)理 5min。

6） 室(shi)溫條件下，用 PBS 清(qing)洗細胞 2~3 次，每次 10min。

7） 取 200µl 配制好的(de) TRITC 標記(ji)鬼筆環肽工(gong)作液，覆(fu)蓋(gai)(gai)住蓋(gai)(gai)玻片上的(de)細(xi)胞，室(shi)溫(wen)避光孵育(yu) 30min（通常情(qing)況(kuang)下， 4℃~37℃孵育(yu)皆(jie)可）。 注意：為了(le)降(jiang)低(di)背景，可于 TRITC 標記(ji)的(de)鬼筆環肽工(gong)作液內(nei)加入(ru) 1% BSA；另外，孵育(yu)過(guo)程中(zhong)為了(le)避免溶液揮 發，可將蓋(gai)(gai)玻片轉移到一(yi)個(ge)密封的(de)容(rong)器內(nei)。

8） 用 PBS 清洗蓋玻片 3 次(ci)，每次(ci) 5min。

9） 使用 200µl DAPI 溶(rong)液(ye)（濃(nong)度：100 nM）對(dui)細胞核進(jin)行復(fu)染，約 30s。

10) 用 PBS 清洗蓋玻片(pian)，然(ran)后(hou)倒置(zhi)在已經滴(di)有一滴(di) Fluoromount-GTM 水溶性封(feng)片(pian)劑(ji)的(de)載玻片(pian)上。使(shi)用紙(zhi)巾輕輕檫 掉多余封(feng)片(pian)劑(ji)，然(ran)后(hou)用指甲油永遠封(feng)片(pian)。此法制備的(de)標本玻片(pian)可(ke)置(zhi)于 4℃避光(guang)保存，通常 6 個月內可(ke)繼續做 F-actin 染色分析。 注意：也可(ke)以直接使(shi)用含有 DAPI 的(de)抗熒光(guang)淬(cui)滅封(feng)片(pian)劑(ji)合并步驟 9）10），簡(jian)化(hua)步驟。

11) 熒光顯微鏡或者(zhe)共聚焦顯微鏡下進行熒光觀(guan)察，選擇 TRITC 激發(fa)/發(fa)射(she)濾片（Ex/Em=540/570nm）和 DAPI 激 發(fa)/發(fa)射(she)濾片（Ex/Em=364/454nm）。

羅丹明標記鬼筆環肽 免疫類產品